为什么有时候用等度洗脱，有时候用梯度洗脱？

经常接触液相的小伙伴肯定都知道等度洗脱和梯度洗脱这两种说法。顾名思义，等度洗脱是流动相中有机相和水相比例一直保持在一个值不变化；梯度洗脱则是比例随着时间的变化而变化。

那么，这两者的区别是什么呢？什么时候该用哪种洗脱方式？下面用作者的理解和大家分享。

化合物在色谱柱种“跑步"

在色谱柱中，化合物因为极性不同，因此在流动相和固定相之间的保留能力不同，从而发生分离。换句话说，因为化合物“跑"的速度不同，在同样长度的色谱柱中，自然到达“终点"的时间也不同。

可以把色谱分离比作100米赛跑：

跑道 → 色谱柱

运动员 → 化合物

运动员跑步的速度主要取决于其实力和状态，当然场地、跑鞋、风阻等也可能对成绩造成影响。在色谱分离中，色谱保留由极性、分配系数、吸附作用、氢键、离子作用等共同决定，但要论影响最大的，就是化合物的极性。这相当于是运动员自身的实力和状态，而流动相成分和比例的改变，则是可以调控化合物“速度"的主要因素。

因此，这里我们可以将运动员的技巧和实力当成是流动相赋予化合物的速度。每个运动员的技巧和实力都不一样，除了平均速度之外，还存在起跑速度和加速度等差异。假设从起步开始，大家的速度一直保持在各自的最好水平，这种情况下，第一名和最后一名肯定还是差距较大。例如，博尔特和作者相比，分离度会非常理想：博尔特跑100米只需9秒58，而作者9秒58只能跑50米。

然而，当水平相当时，第一名和第二名到达终点的时间差可能很小，甚至只有零点几秒或零点零几秒。这对应到色谱中，就是极性相似的化合物如果速度一直不变，很难分开。要不把跑道变长，要不命令他们将各自的速度等比例下降，但这样会增加分析时间、浪费资源、提高检测成本，还可能导致峰形变差。

幸运的是，如上所述，由于每个运动员的实力和技巧不同，他们可以跑得不一样，这正是我们可以利用的特点。通常，实力更强的运动员（即初速度更大）、技巧更高（加速能力更强），在同样条件下能够达到更大的速度差异，如下图所示。

这相当于是对他们下了另外一个命令，按照不同的加速度来加速，跑最快的博尔特不但一开始就跑得快，加速也快，诺亚·莱尔斯的加速会慢一点，而像作者的话加不加速也无所谓了。

等度洗脱与梯度洗脱

现在回到一开始的问题，分离其实就是通过控制流动相的比例，来调节化合物的速度。等度和梯度洗脱的本质区别就是给化合物下达不同的命令：

等度洗脱：可通过调整比例、柱温、pH改变化合物的保留。

梯度洗脱：通过连续或阶梯改变洗脱强度。

所以，什么时候该用等度洗脱，什么时候该用梯度洗脱，答案就清楚了。

我们想要的理想结果是：化合物在达到色谱柱终点的时候能有很好的分离度。

就像赛跑中，运动员冲线之后，我们可能无法马上知道谁是，还得靠仪器判定；而在色谱分析中，我们当然希望用眼睛就能直接区分各组分。

案例分析

色谱柱：Ultimate XB-C18 4.6×100 mm 3μm

等度洗脱

流动相：A = 乙腈，B = 0.1%甲酸水溶液

比例：A:B = 5:95

流速：0.5 mL/min

总结与建议

一般情况下，可以使用保留差异（k 值范围）来判断是否使用梯度洗脱，通常认为 1 < k < 10 是最佳保留范围。对于组分较多的情况，也可放宽到0.5~20，因此色谱中的目标物可根据此参考值来选择适合的洗脱方式进行调整。

但这并不是绝对的，需要我们根据实际情况来进行分析，欢迎大家进行讨论和经验交流。